Agarose-Gelektrophorese

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Agarose-Gelektrophorese
Methode
Englische Bezeichnung Agarose gel electrophoresis
Was kann gemessen werden? Relative Länge von DNA- oder RNA-Strängen
Zeitl. Aufwand insgesamt ca. 3 Std 30 min (mit Probenaufbereitung)
Aufbereitung
Generell mögliche Aufbereitungsarten? Polymerasekettenreaktion
Aufbereitungsarten (an LMU)? Polymerasekettenreaktion
Erforderliche Probenmenge Am effektivsten zwischen 100 bp (Basenpaaren) und 25 kb (kilo Basenpaare)
Zeitl. Aufwand Probenaufbereitung (inkl. Reinigung) ca. 2 Std 15 min (30 min Vorbereitung, 1 Std 45 min Durchführung)
Messprozedur
Kalibration notwendig ✘ Nein
Administrator notwendig ✔ Ja
Messung = Dienstleistung ✔ Ja
Messung selbständig möglich (nach Einweisung) ✔ Ja
Dauer der Messung pro Probe ca. 1 Std 15 min abhängig von Proben und Gel (10 min vorbereiten, 30 min aushärten, 15-25 min an Strom angeschlossen, 10 min Check am PC)
Ausgabeformat Optische Darstelleung der Längen der DNA-/RNA-Fragmente
Bilder
DNA Analyse.png
Ergebnis 10 verschiedener Proben (5 links und 5 rechts einer DNA-Leiter) unter UV-Licht (erstellt von M. Dirnberger, 2019)

Die Agarose-Gelektrophorese ist eine molekularbiologische Methode zur Aufteilung und Sortierung von DNA- oder RNA-Strängen nach ihrer Länge.



Grundprinzip

Die Gelelektrophorese beruht darauf, dass sich kleinere Fragmente der DNA schneller durch ein unter eletrischer Spannung stehendes Agarose-Gel bewegen als längere. Auf diese Weise können DNA-Fragmente schnell der Länge nach sortiert werden.

Um das Gel herzustellen, wird Agarosepulver mit einem TAE-Puffer in einem bestimmten Verhältnis vermischt und anschließend erhitzt, bis das Pulver vollständig gelöst ist. Dann wird ein fluoreszierender Farbstoff hinzugegeben. Das Gel wird vorsichtig in einen Schlitten (Gelform) gegossen. Bevor das Gel abkühlt, müssen entsprechend der Probenzahl Kämme in das abkühlende Gel eingesetzt werden, um Hohlräume für die Proben zu schaffen.

Nachdem das Gel abgekühlt ist, werden wenige µl der Proben und eine DNA-Leiter (Standard mit bekannten Längen) in die verschiedenen Taschen pipettiert. Ein elektrisches Feld wird angelegt, wodurch sich die negativ geladenen RNA- oder DNA-Fragmente durch das Agarose-gel in Richtung der positiv geladenen Anode bewegen.

Spezielle Anforderungen an die Probennahme und –aufbereitung, Reinigung

Bevor mit der Gelelektrophorese begonnen werden kann muss zunächst DNA extrahiert und eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt werden. Typische Agarose-Gele sind am effektivsten bei der Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 100 bp und 25 kb (Lee, P. et al, 2012). D.h. die Probemenge sollte in dem Bereich liegen.

Fehlerquellen

  • Kontamination der Proben durch Fremd-DNA (größte Fehlerquelle)
  • lange Aufbewahrungszeiten der Probe lässt deren Qualität, durch Denaturierung, sinken
  • Laufzeit des elektrischen Feldes und das korrekte Laden der Proben in das Gel sind wichtig

Auswertung

Durch den fluoreszierenden Farbstoff können die Fragmentlängen der Proben, mit den bekannten Fragmentlängen aus dem DNA-Leiter unter UV-Licht bestimmt werden, um zu prüfen, ob das richtige Fragmentstück amplifiziert wurde.

Vor- und Nachteile / Fazit

  • Relativ schnelle Ergebnisse
  • Vergleichsweise günstig
  • Verwendung von kommerziellen Systemen aus Fertiggelen und Pufferlösungen zwecks Qualitätmaximierung empfohlen

Einsatzbereiche

  • Geobiologie
  • Biologie & Medizin (z.B. Serumprotein-Elektrophorese)
  • DNA-Fragmentierung zur Typisierung von Mikroorganismen, Genetik und Forensik

Ausstattung an der LMU

https://www.palaeontologie.geowissenschaften.uni-muenchen.de/ueber_uns/einricht/molecular_lab/index.html

Lehrveranstaltungen

Theorie und Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese ist Teil der Lehrveranstaltungen:

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Literatur

  • Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).
  • Westermeier R. (2019) Agarosegelelektrophorese. In: Gressner A.M., Arndt T. (eds) Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Springer Reference Medizin. Springer, Berlin, Heidelberg

Referenzen


Autor:innen

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Dieser Artikel wurde erstellt von:
Moritz Dirnberger, Frank Förster