Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction; PCR) ist eine Methode der Molekularbiologie, bei der ein bestimmter Abschnitt einer vorher extrahierten DNA für weitere Bearbeitungen, wie einer Agarose-Gelelektrophorese, vervielfältigt wird (DNA-Analyse).
Grundprinzip
Die PCR läuft in drei Schritten ab, die zyklisch wiederholt werden. Im ersten Schritt, der Denaturierung, werden die Bindungen der Doppelstränge der DNA aufgelöst, wodurch sie in zwei Einzelsträngen vorliegt. Im zweiten Schritt, dem Annealing, lagern sich sogenannte Primer an diese Einzelstränge an. Dabei handelt es sich um kurze DNA-Fragmente, die die Region der DNA, die vervielfältigt werden soll, in beide Richtungen festlegen. Im dritten Schritt erfolgt dann die Elongation (= Extension). Die beiden Einzelstränge werden also ausgehend von den Primern wieder zu jeweils einem Doppelstrang vervollständigt.
Vorbereitung
Vor der PCR muss die DNA erst extrahiert werden (DNA-Extraktion). Von der extrahierten DNA können dann Sequenzen mit üblicherweise 100 bis 10000 Basenpaaren vervielfältigt werden.
Benötigte Utensilien
Die folgenden Materialien werden für die PCR benötigt. Die genauen Mengenangaben, sowie einzelne Komponenten können dabei abweichen.
- 1 -4 µL der extrahierten DNA-Lösung
- 0,75 bis 4,75 µL Wasser (abhängig von der Menge der hinzugefügten Template-DNA)
- Je 0,5 µL der beiden Primer
- 0,5 µL Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTPs)
- 0,1 µL DNA-Polymerase
- 2,5 µL PCR-Puffer
- 1,15 µL bovines Serumalbumin (BSA)
- 1,5 µL Magnesiumchlorid
Die neuen DNA-Stränge werden hierbei aus den dNTPs mithilfe der DNA-Polymerase synthetisiert. Der Puffer, das BSA und das Magnesiumchlorid schaffen die chemischen Voraussetzungen, die die PCR benötigt.
Durchführung
All die Materialien werden in einem kleinen Behältnis gemischt und in einen Thermocycler gegeben. Dieser erhitzt und kühlt die Flüssigkeit automatisch nacheinander auf die jeweiligen Temperaturen, die für die drei Schritte der PCR gebraucht werden. Um die Doppelstränge vollständig voneinander zu lösen, werden zuerst 95°C für 5 Minuten gehalten. Die exakten Temperaturen und Zeiten können variieren (abhängig von den PCR-Primern und deren Schmelztemperaturen), ungefähre Angaben für die 3 Hauptschritte der PCR wären:
- Denaturierung: 30 Sekunden bei 95°C
- Annealing: 30 Sekunden bei 55°C (abhängig von den Primern)
- Elongation: 60 Sekunden bei 72°C
Diese drei Schritte werden einige Male (z.B. 35-mal) wiederholt, wobei der gewünschte Abschnitt der DNA bei jeder Wiederholung verdoppelt wird. Am Ende folgt eine End-Elongation mit 3 Minuten bei 72°C. Zusammen mit dem Pipettieren und Mischen der Utensilien ergibt sich eine Dauer von ungefähr zwei Stunden.
Vor- und Nachteile
- Schnelle und einfache Durchführung
- Auch einsetzbar bei geringen Probenmengen
- Einfache Überprüfung mit einer Agarose-Gelelektrophorese möglich
- Anfällig für Kontamination durch Fremd-DNA (z.B. durch DNA der Person, die die PCR durchführt)
- Kein diagnostischer Test, um festzustellen, ob jemand infektiös ist (es ist ein forensischer Test)
Einsatzgebiete
- Geobiologie
- Molekularbiologie (DNA-Barcoding)
- Medizin (Forschung zu Erbkrankheiten)
- Forensik (kleinste DNA-Spuren können mit der PCR vervielfältigt und danach analysiert werden, um festzustellen, ob eine Person an einem Tatort anwesend war)
Lehrveranstaltungen
Einführung in die molekulare Paläobiologie (Lehrveranstaltung)
Standorte an der LMU
Weiterführende Literatur
Erlich, H.A. Polymerase chain reaction. J Clin Immunol 9, 437–447 (1989). https://doi.org/10.1007/BF00918012
Autor:innen
- Dieser Artikel wurde geschrieben und gegengelesen von:
- Moritz Dirnberger, William Orsi
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