DNA-Extraktion
Der erste Schritt, um die DNA eines Organismus untersuchen zu können (DNA-Analyse) besteht in der Extraktion der DNA aus dem Gewebe. Danach kann ein Abschnitt der DNA mithilfe einer Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt werden und mithilfe einer Agarose-Gelelektrophorese untersucht werden.
Grundprinzip
Es gibt verschiedenste Möglichkeiten DNA aus Gewebe zu extrahieren. Im Folgenden wird das Verfahren der Säulenextraktion beschrieben. Hierbei wird das Gewebe einer Probe aufgelöst und ausgewaschen, während die DNA ausgefällt und an einer Silikagel-Membran angelagert wird.
Benötigte Utensilien
Es werden folgende Materialien benötigt:
- Gewebeprobe aus der die DNA extrahiert werden soll
- Detergens, z.B. SDS (sodium dodecyl sulfate)
- Proteinase K
- Chaotrope Salze
- Ethanol
- Waschpuffer
- Wasser
Mithilfe des Detergens, der Proteinase K, und der chaotropen Salze wird das Gewebe aufgelöst und die DNA anschließend durch das Ethanol ausgefällt. Mit den Waschpuffern werden Reste des Gewebes weggespült. Am Ende befindet sich die DNA gelöst im Wasser.
Durchführung
Die Probe wird in ein Mikrozentrifugengefäß gegeben. Gemischt mit dem Detergens (z.B. SDS) und der Proteinase K wird die Probe ein bis drei Stunden lang bei 56°C gelagert. Hierbei werden die im Gewebe befindlichen Lipidmembrane und die Peptidbindungen der Proteine aufgelöst und die Probe somit homogenisiert. Danach werden chaotrope Salze hinzugegeben und die Probe 10 Minuten lang auf 70°C erhitzt, wodurch Wasserstoffbrückenbindungen gelöst und dadurch Proteine (darunter auch die Proteinase K) inaktiviert werden. Nach Zugabe des Ethanols wird die Flüssigkeit in ein anderes Behältnis gefüllt, das eine Silikagel-Membran enthält. Nach einminütigem Zentrifugieren bei 11000g hat sich die gefällte DNA an die Membran angelagert, während sich das gelöste Gewebe im Behältnis befindet. Um die verbleibenden Reste des Gewebes aus der Membran zu spülen, wird sie zweimal in einem neuen Behältnis je eine Minute lang zentrifugiert, während Waschpuffer hinzugegeben wird. Dann wird die Membran durch erneutes Zentrifugieren getrocknet. Zuletzt wird die DNA durch Zentrifugieren mit Wasser in ein Mikrozentrifugengefäß gelöst. Aufgrund der Wartezeit kann die Extraktion insgesamt bis zu vier Stunden dauern.
Das Verfahren der Ethanolfällung kann jedoch durch einfaches Aufkonzentrieren der DNA in der wässrigen Lösung unter Verwendung eines Amicon-Filters mit einer 50 KDa-Membran ersetzt werden. Dadurch wird die qualitativ hochwertige genomische DNA konzentriert und die erhaltene DNA-Menge im Vergleich zu einer Ethanolfällung um etwa das Zehnfache erhöht. Um die DNA mit dem Amicon-Filter zu konzentrieren, wird einfach die Lösung in den Amicon-Filter gegeben und zentrifugiert, bis genügend Flüssigkeit durch die Membran geflossen ist und die gewünschte Konzentration erreicht ist.
Vor- und Nachteile
- Schnelle und einfache Durchführung
- Einsetzbar sowohl bei geringer als auch bei großer Probenanzahl
Einsatzgebiete
- Geobiologie
- Molekularbiologie
- Medizin
- Forensik
Lehrveranstaltungen
Einführung in die molekulare Paläobiologie (Lehrveranstaltung)
Standorte an der LMU
Autor:innen
- Dieser Artikel wurde geschrieben und gegengelesen von:
- Moritz Dirnberger, William Orsi
- Du möchtest wissen, wer hinter den Autor:innen und Reviewer:innen steckt? Dann schau doch beim GEOWiki-Team vorbei!
