Agarose-Gelelektrophorese
| Agarose-Gelelektrophorese | |
|---|---|
| Methode | |
| Englische Bezeichnung | Agarose gel electrophoresis |
| Was kann gemessen werden? | Relative Länge von DNA- oder RNA-Strängen |
| Zeitl. Aufwand insgesamt | ca. 3 Std 30 min (mit Probenaufbereitung) |
| Aufbereitung | |
| Generell mögliche Aufbereitungsarten? | Polymerase-Kettenreaktion |
| Aufbereitungsarten (an LMU)? | Polymerase-Kettenreaktion |
| Erforderliche Probenmenge | Am effektivsten zwischen 100 bp (Basenpaaren) und 25 kb (kilo Basenpaare) |
| Zeitl. Aufwand Probenaufbereitung (inkl. Reinigung) | ca. 2 Std 15 min (30 min Vorbereitung, 1 Std 45 min Durchführung) |
| Messprozedur | |
| Kalibration notwendig | Nein |
| Administrator notwendig | Ja |
| Messung = Dienstleistung | Ja |
| Messung selbständig möglich (nach Einweisung) | Ja |
| Dauer der Messung pro Probe | ca. 1 Std 15 min abhängig von Proben und Gel (10 min vorbereiten, 30 min aushärten, 15-25 min an Strom angeschlossen, 10 min Check am PC) |
| Ausgabeformat | Optische Darstellung der Längen der DNA-/RNA-Fragmente |
| Bilder | |
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Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine molekularbiologische Methode zur Aufteilung und Sortierung von DNA- oder RNA-Strängen nach ihrer Länge.
Grundprinzip
Die Gelelektrophorese beruht darauf, dass sich kleinere Fragmente der DNA schneller durch ein unter eletrischer Spannung stehendes Agarose-Gel bewegen als längere. Auf diese Weise können DNA-Fragmente schnell der Länge nach sortiert werden.
Um das Gel herzustellen, wird Agarosepulver mit einem TAE-Puffer in einem bestimmten Verhältnis vermischt und anschließend erhitzt, bis das Pulver vollständig gelöst ist. Dann wird ein fluoreszierender Farbstoff hinzugegeben. Das Gel wird vorsichtig in einen Schlitten (Gelform) gegossen. Bevor das Gel abkühlt, müssen entsprechend der Probenzahl Kämme in das abkühlende Gel eingesetzt werden, um Hohlräume für die Proben zu schaffen.
Nachdem das Gel abgekühlt ist, werden wenige µl der Proben und eine DNA-Leiter (Standard mit bekannten Längen) in die verschiedenen Taschen pipettiert. Ein elektrisches Feld wird angelegt, wodurch sich die negativ geladenen RNA- oder DNA-Fragmente durch das Agarose-gel in Richtung der positiv geladenen Anode bewegen.
Spezielle Anforderungen an die Probennahme und –aufbereitung, Reinigung
Bevor mit der Gelelektrophorese begonnen werden kann muss zunächst DNA extrahiert und eine Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt werden. Typische Agarose-Gele sind am effektivsten bei der Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 100 bp und 25 kb (Lee, P. et al, 2012). D.h. die Probemenge sollte in dem Bereich liegen.
Fehlerquellen
- Kontamination der Proben durch Fremd-DNA (größte Fehlerquelle)
- lange Aufbewahrungszeiten der Probe lässt deren Qualität, durch Denaturierung, sinken
- Laufzeit des elektrischen Feldes und das korrekte Laden der Proben in das Gel sind wichtig
Auswertung
Durch den fluoreszierenden Farbstoff können die Fragmentlängen der Proben, mit den bekannten Fragmentlängen aus dem DNA-Leiter unter UV-Licht bestimmt werden, um zu prüfen, ob das richtige Fragmentstück amplifiziert wurde.
Vor- und Nachteile / Fazit
- Relativ schnelle Ergebnisse
- Vergleichsweise günstig
- Verwendung von kommerziellen Systemen aus Fertiggelen und Pufferlösungen zwecks Qualitätmaximierung empfohlen
Einsatzbereiche
- Geobiologie
- Biologie & Medizin (z.B. Serumprotein-Elektrophorese)
- DNA-Fragmentierung zur Typisierung von Mikroorganismen, Genetik und Forensik
Ausstattung an der LMU
Lehrveranstaltungen
Theorie und Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese ist Teil der Lehrveranstaltungen:
- Einführung in die molekulare Paläobiologie (Lehrveranstaltung)
- Einführung in die Biophysik (Lehrveranstaltung und Seminar)
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Literatur
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).
- Westermeier R. (2019) Agarosegelelektrophorese. In: Gressner A.M., Arndt T. (eds) Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik. Springer Reference Medizin. Springer, Berlin, Heidelberg
Referenzen
Autor:innen
- Dieser Artikel wurde geschrieben und gegengelesen von:
- Moritz Dirnberger, Frank Förster
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